Одним из первых в этом пытался разобраться русский физик Г. Гамов, эмигрировавший в то время в Америку. Наслушавшись многочисленных разговоров о ДНК и узнав, что она содержит — как и карты — всего четыре «масти», Гамов решил «разложить пасьянс» с целью понять устройство генетического кода. Ему сразу стало ясно, что код не может быть «двоичным», то есть одну аминокислоту в белке должна кодировать не двойка нуклеотидов — «букв», а как минимум тройка. Дело в том, что сочетание из 4 по 2 дает всего 16 комбинаций, а этого недостаточно для кодирования всех 20 аминокислот. Следовательно, рассуждал Гамов, код должен быть по крайней мере трехбуквенным, то есть каждую аминокислоту должна кодировать тройка «букв» в любых сочетаниях. На этом он и остановился, поскольку далее возникало множество вопросов. В частности, такой: число сочетаний из 4 по 3 равно 64, а аминокислот всего 20. Зачем же такая избыточность в трехбуквенном коде?
В то время уже существовал хорошо известный путь, который, в частности, был проделан в свое время французом Жаном Шампольоном при дешифровке иероглифов древнего Египта. В качестве основного подспорья для решения стоящей перед ним задачи он использовал базальтовую плиту, которую обнаружили во время военной компании Наполеона в Египет и которая получила название Розеттский камень. На плите одновременно присутствовали две надписи: одна была иероглифическая, а другая — сделанная греческими буквами на греческом языке. К счастью, и язык, и письмо древних греков были в то время уже хорошо известны ученым. В результате сравнение двух текстов Розеттского камня привело к расшифровке египетской иероглифики. Этим путем и двинулись ученые при расшифровке генетического кода. Надо было сравнить два текста: текст, записанный в ДНК, с текстом, записанным в белке. Однако первоначально ученые не умели «читать» ДНК, а одного известного в то время белкового текста было недостаточно. Пришлось искусственно синтезировать разнообразные короткие фрагменты РНК и синтезировать на них в искусственных системах фрагменты белка. Весной 1961 года в Москве на Международном биохимическом конгрессе М. Ниренберг сообщил, что ему удалось «прочесть» первое «слово» в ДНКовом тексте. Это была тройка букв — ААА (в РНК, соответственно, УУУ), то есть три аденина, стоящие друг за другом, — которая кодирует аминокислоту фенилаланин в белке. Так было положено начало расшифровке генетического кода.
Такой путь в конечном итоге вскоре привел к полной расшифровке генетического кода. Подтвердилось предположение Гамова, что код триплетный: одной аминокислоте в белках соответствует последовательность из 3 нуклеотидов в ДНК и РНК. Такие кодирующие тройки нуклеотидов — «слова» — получили название кодонов.
Напомним, что еще Гамов столкнулся с парадоксом: из четырех нуклеотидов может быть построено 64 разных кодонов, а для построения белков используется только 20 различных аминокислот. Решение этого парадокса оказалось в следующем. Большинство аминокислот может кодироваться несколькими кодонами. После выяснения этого обстоятельства генетический код назвали вырожденным.
В таблице 1 приведены кодоны, но не в самой ДНК, а в РНК-посреднике (матричной РНК, или мРНК), образующейся на ДНК, и соответствующие им аминокислоты в белках.
Кроме того, как видно из таблицы, реально для кодирования используются не все возможные кодоны. Три из этих «лишних» кодонов выполняют функцию стоп-сигналов, обеспечивая прекращение синтеза белковой цепи.
Если внимательно посмотреть на таблицу 1, то видно, что вырожденность генетического кода носит не совсем случайный характер. Хотя код триплетный, основную нагрузку несут первые два нуклеотида в каждом кодоне. Чаще всего в разных кодонах, кодирующих одну и ту же аминокислоту, отличается лишь третий нуклеотид.
Таблица 1. Генетический словарь. Указаны аминокислоты, встречающиеся в белках, и соответствующие им кодоны в комплементарной ДНК матричной РНК
Генетический код первоначально был расшифрован у таких простых организмов, как фаги и бактерии. В дальнейшем оказалось, что он универсален (за очень редким исключением) для геномов всех существующих ныне живых организмах (от бактерий до человека). Небольшие отличия, о которых мы поговорим далее, были выявлены при сравнении ядерного и митохондриального геномов.
Итак, как в привычном нам тексте книги, вся информация записана в ДНК последовательностью расположения четырех составляющих ее «букв» — нуклеотидов. Таким образом, ДНКовый текст написан с помощью А, Т, Ц, Г-алфавита. При этом только текст одной из двух цепей ДНК обычно кодирующий, а другая цепь, как правило, некодирующая. Хотя известно, что в каждом правиле есть исключения. Если читатель попробует написать этими четырьмя буквами какие-нибудь русские слова, то у него ничего не получится. «Словом» в ДНКовом тексте, условно говоря, служит определенное сочетание трех нуклеотидов, которому соответствует конкретная аминокислота в белке, являющемся также полимером. Таким образом, в клетке четырьмя буквами записано два десятка «слов» (аминокислот — составных частей белков). И, наконец, как «предложение» в ДНКовом тексте можно рассматривать полный набор триплетов, кодирующих определенный белок, то есть ген. Таким образом, генетический алфавит состоит всего из 4 букв, а генетический словарь из 20 слов. В этой связи вспомним, что даже словарь Эллочки-людоедки из романа И. Ильфа и Е. Петрова «Двенадцать стульев» состоял из 30 слов, а «Словарь языка произведений А. С. Пушкина» насчитывает примерно 20 тыс. слов.
Существует строгая закономерность: чем длиннее код (чем больше в нем знаков), тем короче тексты. Огромный по размерам код представляют собой, например, китайские иероглифы. В результате этого иероглифические тексты существенно более кратки по сравнению с другими системами письма, в том числе и нашей. Однако для создания генетического кода природа выбрала всего 4 «буквы». Такой код предполагает наличие длинных текстов, что и реализовалось природой в виде создания гигантских молекул ДНК. При написании полного «текста» генома человека потребовалось около 3,2 млрд. «букв». Для сравнения: в священной книге Бытия, написанной на древнееврейском языке, содержится всего 78100 букв.
Размножение ДНК (репликация)
Важно то, что структура ДНК, открытая Уотсоном и Криком, многое прояснила относительно разных механизмов функционирования этой молекулы в клетке. ДНК не только кодирует генетическую информацию, но и самовоспроизводится (удваивается) при каждом клеточном делении. И вскоре уже было экспериментально установлено, что одновременно с делением клетки ДНК снимает с самой себя точные копии в процессе удвоения, или репликации. Во время клеточного деления слабые связи между двумя цепями двойной спирали ДНК разрушаются, в результате чего нити разделяются. Затем на каждой из них строится вторая «дочерняя» (комплементарная) цепь ДНК. В результате этого молекула ДНК удваивается, как и клетка, и в обеих клетках оказывается по одной полной копии ДНК. Копии должны быть полностью идентичными, чтобы сохранить всю генетическую информацию.
Процесс репликации играет ключевую роль в сохранении одной и той же генетической информации в разных клетках, образующихся при их делении. В общем виде художественно он изображен на рис. 5. Однако реальные механизмы репликации довольно сложны, и до настоящего времени еще не все тонкие детали этого процесса известны, особенно применительно к геномам высших животных организмов, включая человека.
Рис. 5. Схема репликации ДНК
В общем виде этот процесс выглядит следующим образом. В каждой хромосоме ДНК удваивается не с начала до конца, а отдельными кусками (репликонами). Средний размер репликона составляет около 30 мкм. Тем самым в составе генома человека должно встречаться более 50 000 репликонов, участков ДНК, которые синтезируются в ядре как независимые единицы. И это имеет свой глубокий смысл. Если бы каждая из молекул ДНК удваивалась как один репликон от начала до конца молекулы, то при скорости синтеза 0,5 мкм в минуту (а она именно такова у человека) удвоение первой хромосомы, имеющей длину ДНК около 7 см, занимало бы 140 000 минут, или около трех месяцев. На самом деле благодаря полирепликонному строению молекул ДНК весь процесс занимает всего 7–12 часов. Отдельные относительно короткие репликоны соединяются друг с другом, обеспечивая этим процесс воспроизведения целой молекулы ДНК.
Перезапись генетического текста и перевод в белковый текст (транскрипция и трансляция)
В клетке ДНК служит в качестве матрицы, на которой первоначально происходит синтез разных РНК. Процесс перезаписи генетической информации из ДНК в РНКовый текст получил название транскрипция. Этот процесс, как и репликация ДНК, осуществляется в ядрах клеток. Первоначально на генах, кодирующих белки, образуются РНК-предшественники, которые после ряда модификаций превращаются в так называемые матричные РНК (мРНК). Они-то непосредственно и служат матрицей для синтеза белков, то есть их кодируют. Установлено, что мРНК служат не только носителями ДНКовой информации, но и переносчиками этой информации из ядра в цитоплазму клетки. Только там мРНК может играть роль матрицы для синтеза белковых молекул (этот процесс назван трансляцией). В цитоплазме на специфических «машинах» — рибосомах — осуществляется при трансляции мРНК синтез молекулы белка, т. е. происходит перевод информации с четырехбуквенного языка мРНК на двадцатибуквенный язык белка. Схематически этот процесс изображен на рис. 6.
В середине 60-х годов был сформулирован основной постулат (центральная догма) новой науки — молекулярной биологии, который первоначально выглядел следующим образом:
ДНК > РНК > белок.
Рис. 6. Процесс трансляции мРНК на рибосомах с образованием белка
Рибосома играет роль «машины», читающей генетическую информацию, записанную в мРНК. Это молекулярная машина, построенная по единой схеме у всех организмов (включая человека) с небольшими вариациями. Она состоит из двух рибонуклеопротеидных (состоящих из РНК и белков) субчастиц: малой и большой. На рибосоме происходит взаимодействие мРНК с транспортными РНК (тРНК), несущими по одной аминокислоте каждая. Белок синтезируется путем образования связей между последовательно доставляемыми тРНК аминокислотами. Этим процессом «руководит» сама рибосома.
Позднее этот постулат был уточнен, и теперь он выглядит как
Сделанное дополнение вызвано обнаружением в 1970 году такого явления, как обратная транскрипция. Выяснилось, что у некоторых вирусов, генетический аппарат которых представлен РНК, а не ДНК, как у других живых организмов, имеется специальный фермент, который позволяет осуществлять такой обратный процесс, как синтез ДНК на РНК. Этот фермент получил название обратная транскриптаза, или ревертаза.
Казалось бы, теперь уже все стало ясно и однозначно и более ничего не может измениться. Но, как писал Марк Твен: «Из жизненного опыта следует извлекать только полезное и ничего больше, — иначе мы уподобимся кошке, присевшей на горячую печку. Она никогда больше не сядет на горячую печку — и хорошо сделает, но она никогда больше не сядет и на холодную». Ряд открытий последних лет продолжает вносить уточнения в казавшуюся незыблемой центральную догму молекулярной биологии.
Во-первых, выяснилось, что центральная догма молекулярной биологии постулирует лишь путь передачи генетической информации от нуклеиновых кислот к белкам и, следовательно, к конкретным свойствам и признакам живого организма. Однако исследование механизмов реализации этого пути на протяжении нескольких десятилетий, последовавших за формулировкой центральной догмы, вскрыло гораздо более разнообразные функции РНК, помимо известных ранее.
Во-вторых, согласно первоначальной догме, все носители инфекционных болезней должны иметь генетический материал — ДНК или РНК. Оказалось, что и здесь есть исключения. В 1997 году Нобелевская премия была вручена Стэнли Прузинеру за открытие белковых инфекционных частиц, вызывающих такое заболевание, как, например, болезни «коровьего бешенства», или почесухи. Эти частицы были названы прионами. Проникая в клетку-хозяина, прионы «навязывают» свою болезнетворную конформацию (измененную пространственную структуру) нормальным белкам-аналогам, содержащимся в клетках. При этом ни РНК, ни ДНК никак не участвуют в развитии заболевания. Иными словами, при прионовых заболеваниях информация передается не от одной нуклеиновой кислоты к другой нуклеиновой кислоте, а от белка к белку, что в исходном варианте центральной догмы не предусматривалось.
Однако все эти дополнения в «центральную догму» молекулярной биологии не повлияли принципиально на ее общую закономерность. В центре всего и вся стоял и стоит ген. Сегодня он перестал быть чем-то таинственным, стал реальным химическим веществом, появилась возможность судить о нем так же, как и о других химических соединениях живых организмов, изучать с помощью доступных генетикам и биохимикам методов. Стало понятным, что такое генетический код и как реализуется в клетке та информация, которая записана в ДНКовом тексте. В результате этого в 1953 году родилась молекулярная генетика — раздел науки, который занялся детальным изучением процессов работы ДНК в клетке на молекулярном уровне.
Расшифровка химической и пространственной структуры ДНК — носителя генетической информации — оценена во всем мире как одно из наиболее выдающихся открытий XX века. Геном стоит в центре всех биологических проблем, всех свойств и способностей человека, всего разнообразия человека. Теперь это уже аксиома. Как говорил Козьма Прутков: «Многие люди подобны колбасам: чем их начинят, то и носят в себе». Так вот, мы «начинены» ДНК, носим ее в себе, а она-то, главным образом, и определяет многое в нас.
ДЛИННАЯ ИСТОРИЯ СО СЧАСТЛИВЫМ КОНЦОМ
Сначала неизбежно идут: мысль, фантазия, сказка.
За ними шествует научный расчет.
И уже, в конце концов, исполнение венчает мысль.
К. Э. Циолковский
Начало — половина целого.
Пифагор
После открытия структуры ДНК и расшифровки содержащегося в ней генетического кода сразу же начался следующий важный этап — изучение организации целых геномов. Но до прямого определения всех нуклеотидных последовательностей гигантских молекул ДНК было еще очень далеко. Дело в том, что в 60-х и начале 70-х годов прошедшего столетия технические возможности и методические подходы к исследованиям столь больших биологических молекул были еще весьма несовершенны. Однако энтузиазм ученых после установления основных особенностей структуры ДНК был огромным, и на эту главную молекулу жизни навалились со всех возможных сторон многочисленные специалисты, используя все доступные на то время методы и средства.
Хромосомы дают первые сведения о структуре генома
Выше уже говорилось, что в ядре клетки молекулы ДНК расположены в особых структурах, получивших названиехромосомы. Их исследование началось еще свыше 100 лет назад с помощью обычного светового микроскопа. Уже к концу XIX века выяснилось кое-что о поведении хромосом в процессе деления клеток и высказывалась мысль об их участии в передаче наследственности.
Хромосомы становятся видимыми в микроскопе при делении клетки на определенной стадии клеточного цикла, называемой митозом. Хромосомы в этом состоянии представляют собой компактные палочковидные структуры разной длины с довольно постоянной толщиной, у большей части хромосом имеется перетяжка, которая делит хромосому на два плеча. В области перетяжки расположена важная для удвоения хромосом структура, называемая центромерой. При делении клетки в ходе митоза происходит удвоение числа хромосом, в результате которого обе вновь образующиеся клетки в конечном итоге обеспечиваются одним и тем же стандартным набором хромосом.
Лишь в 1956 г. впервые Ю. Тио и A. Леван описали хромосомный набор человека, определили количественный состав хромосом и дали их общую морфологическую характеристику. По сути дела эти работы и положили начало изучению структуры генома человека. У человека в каждой клетке тела содержится 46 хромосом, физические длины которых находятся в пределах от 1,5 до 10 мкм (рис. 7).
Рис. 7. Вид под микроскопом полного набора хромосом, содержащихся в ядре каждой отдельной клетки человека
Напомним читателю, что набор хромосом во всех клетках человека (за исключением половых) называют диплоидным (двойным), поскольку каждая из хромосом представлена двумя копиями (всего 23 пары). Каждая соматическая клетка человека (кроме красных кровяных клеток крови) содержит по 2 полных набора хромосом. В каждом единичном (гаплоидном) наборе присутствует 23 хромосомы — 22 обычные хромосомы (аутосомы) и по одной половой хромосоме — X или Y. Таким образом, геном каждого конкретного человека состоит из 23 пар гигантских молекул ДНК, распределенных в разных хромосомах, а если говорить о геноме человека вообще (мужчин и женщин), то общее число таких молекул равно 24. Это первое базовое сведение, которое было получено о геноме человека при анализе хромосом.
Изучение строения (размера и формы) хромосом человека показало, что большинство из них по внешнему виду напоминают кегли, состоящие из двух толстых частей (хроматид) и тонкой перетяжки (центромеры) между ними. Сходство с кеглями, а не с гантелями заключается в том, что центромера чаще всего расположена не в центре хромосомы, а смещена к одному из ее концов. Размеры хромосом сильно варьируют, самая короткая хромосома примерно в десять раз меньше, чем самая длинная. Это второе принципиально важное сведение о структуре генома человека — составляющие его 24 молекулы ДНК имеют разный размер.
Если сравнивать число и размер хромосом у человека и у других видов организмов, то можно увидеть огромные отличия. Например, у коровы, размер генома которой примерно равен геному человека, имеется 60 пар хромосом. У шпорцевой лягушки содержится всего 18 хромосом, но даже самые маленькие из них больше, чем самые крупные хромосомы человека. У птиц, наоборот, число хромосом достигает 40 и более и все они очень небольшие по размерам. Таким образом, разнообразие хромосом в природе весьма велико.
С помощью световой микроскопии были определены размеры всех хромосом человека. Затем все неполовые хромосомы были пронумерованы по уменьшению размера — от 1 до 22. Половым хромосомам не присвоили номер, а назвали X и Y. Как показали более точные последующие исследования, хромосома 21 реально оказалась чуть меньше 22, однако нумерацию хромосом не изменили (чтобы не вносить путаницу). Различие в хромосомных наборах между мужчинами и женщинами состоит в том, что у женщин имеются две половые X-хромосомы (т. е. хромосомы во всех 23-х парах одинаковы), а у мужчин пару с X-хромосомой образует мужская половая хромосома — Y. Каждую хромосому можно рассматривать как отдельный том большого двадцатичетырехтомного собрания сочинений под названием Энциклопедия человека.
Половые клетки человека, в отличие от клеток тела взрослого организма (соматических клеток), содержат не 2 набора томов ДНКового текста, а всего лишь один. Перед зачатием каждая отдельная хромосома (отдельный том в Энциклопедии человека) сперматозоида отца и яйцеклетки матери состоят из смешанных в разном сочетании различных глав ДНКового текста их родителей. Любая из хромосом, полученная нами от отца, образовалась в его семенниках незадолго до того, как мы были зачаты. Ранее, за всю историю человечества, точно такая хромосома никогда не существовала. Она была сформирована в процессе случайного перемешивания, происходящего при делении, постепенно образуясь из объединяющихся друг с другом участков хромосом предков со стороны отца. Также обстоит дело и с хромосомами яйцеклеток, за исключением того, что они формируются в организме нашей матери задолго до нашего рождения (почти сразу после рождения самой матери).
В зиготе, образующейся в результате слияния сперматозоида и яйцеклетки, материнские и отцовские гены смешиваются и перетасовываются в разных сочетаниях. Это происходит в результате того, что хромосомы не остаются неизменными в поколениях — они вступают во взаимодействие со своей случайно встреченной парой, обмениваясь с ней материалом. Такой постоянно идущий процесс получил название рекомбинации. И следующему поколению часто достается уже гибридная хромосома — часть от дедушки и часть от бабушки. Далее в ряду поколений пути генов постоянно пересекаются и расходятся. В результате слияния уникальной яйцеклетки с уникальным сперматозоидом и возникает уникальный во всех отношениях геном. И в этом смысле все мы уникумы. Каждый человеческий индивид хранит уникальную генетическую информацию, состоящую из случайной комбинации разных вариантов генов.
Отдельный ген можно рассматривать как единицу, продолжающую существовать в ряду многочисленных поколений. И в этом смысле ген бессмертен! Существует даже такая оригинальная точка зрения, что не сами люди, а их гены правят миром, а каждый конкретный живой организм служит лишь временным прибежищем для них. Эта не бесспорная мысль принадлежит Ричарду Докинзу, автору книги «Эгоистичный ген». По его мнению, гены практически бессмертны в отличие от живых организмов, в которых они существуют. Некоторым генам десятки и даже сотни миллионов лет. Гены, пользуясь терминологией Докинза, делают все возможное, чтобы выжить. Приспосабливаются к жаре и холоду, выбирая себе местечко получше, мигрируют с помощью человека и вступают в новые комбинации. Человек оказался довольно непоседливым хозяином. За тысячи лет он сильно исколесил мир, распространяя свое присутствие, влияние и свою начинку — гены. (Подробнее с идеями и аргументацией Р. Докинза любознательный читатель может познакомиться вПриложении 1). Такая точка зрения далеко не бесспорна, и из дальнейшего изложения нам станет понятно, что гены — это в первую очередь не эгоисты, а трудоголики. Имеются гены — «сторожа» генома, гены — «дворники», гены — «повара» и гены — «домоуправители». Обеспечивая свое существование, они обеспечивают и существование нас.
Сразу после зачатия будущий человек представляет собой всего одну клетку (зиготу), наделенную одной исходной ДНКовой библиотекой, содержащей 46 томов. Среди 46 томов всегда 23 получены от отца, а другие 23 — от матери. Тексты 23 отцовских и 23 материнских томов хотя и очень сходны в целом, тем не менее отличаются в деталях. Например, в отцовском томе № 18 на странице 253 существует предложение-предписание (в виде гена), в котором сказано, что глаза у ребенка должны быть карими, а в этом же материнском томе на той же странице тоже написано о цвете глаз, но согласно этому тексту цвет должен быть голубыми. Первое указание более строгое (доминирующее), чем второе, и в результате у ребенка глаза будут иметь карий цвет. Ген, который диктует свои права, называютдоминирующим, а тот, который уступает свои права, — рецессивным. Голубой цвет глаз имеют только те люди, у которых и в материнском, и в отцовском тексте содержатся рецессивные гены, в которых есть указание на голубоглазость. Затем зигота делится на две клетки, каждая из них вновь делится и так до появления миллиардов клеток. Схематически процесс деления клеток изображен на рис. 8.
При каждом делении клетки содержащиеся в библиотеках тома ДНКового текста точно копируются, причем практически без ошибок. Организм взрослого человека состоит в среднем из 1014 клеток. Например, в головном мозге и печени насчитывается примерно по 10 млрд. клеток, в иммунной системе — 300 млрд. клеток. В течение всей жизни человека в его организме происходит около 1016 клеточных делений. Клеточный состав многих органов за 70 лет жизни обновляется несколько раз. И каждая из этих клеток содержит одни и те же 46 томов ДНКового текста.
В конце 60-х годов XX века был осуществлен важный прорыв в исследовании хромосом. Обусловлен он был всего лишь тем, что для их окраски стали использовать специальное контрастное вещество — акрихин-иприт, а затем и другие сходные с ним соединения. Такая окраска позволила выявить внутри хромосом большое число разных субструктур, которые не обнаруживались под микроскопом без окрашивания. После окрашивания хромосом специфическим красителем Гимза-Романовского они выглядят как зебры: вдоль всей длины видны поперечные светлые и темные полосы, имеющие окраску разной интенсивности.
Рис. 8. Основные стадии клеточного цикла, приводящего к делению клетки
Эти полосы получили название хромосомных G-сегментов или полос (рис. 9). Картина сегментации сильно отличается у разных хромосом, но расположение хромосомных сегментов постоянно у каждой из хромосом во всех типах клеток человека.
Природа полос, выявляемых при окраске, до конца еще не ясна. Сейчас установлено только, что участки хромосом, соответствующие темным полосам (названные R-полосами), реплицируются раньше, чем светлые участки (названные G-полосами). Таким образом, полосатость хромосом скорее всего все же имеет некий до конца еще не понятый смысл.
Окрашивание хромосом очень облегчило их идентификацию, а в дальнейшем способствовало определению расположения на них генов (картированию генов).
Рис. 9. Специфические хромосомные G-сегменты, выявляемые при окраске хромосом человека, и система их обозначения согласно решению международной конференции в Париже в 1971 году. Цифрами под хромосомами указаны их номера. X и Y — половые хромосомы, p — короткое плечо, q — длинное плечо хромосом
Хотя детальные процессы, происходящие при окрашивании, еще не до конца ясны, очевидно, что картина окраски зависит от такого параметра, как увеличенное или уменьшенное содержание в отдельных полосах хромосом АТ или ГЦ-пар. И это еще одно общее сведение о геноме — он не однороден, в нем есть районы, обогащенные определенными парами нуклеотидов.
Это, в частности, может быть связано с повторяемостью некоторых типов нуклеотидных последовательностей ДНК в определенных районах.
Дифференциальная окраска хромосом нашла широкое применение для выявления и идентификации небольших индивидуальных изменений генома конкретного человека (полиморфизма), в частности, приводящих к различным патологиям. Примером этому может служить обнаружение так называемой филадельфийской хромосомы, встречающейся у больных с хроническим миелоидным лейкозом. С помощью окраски хромосом установлено, что у пациентов с этим заболеванием определенный фрагмент исчезает на хромосоме 21 и появляется на конце длинного плеча хромосомы 9 (перенос фрагмента или транслокация, сокращенно t). Генетики обозначают такое событие как t (9; 21). Таким образом, хромосомный анализ свидетельствует о том, что разные молекулы ДНК могут обмениваться между собой отдельными участками, в результате чего в геноме образуются «гибриды», состоящие из молекул ДНК разных хромосом. Анализ уже изученных свойств хромосом позволил сформировать представление о полиморфизме генома человека.
Для выяснения локализации отдельных генов на хромосомах (то есть картирования генов) используют целый арсенал специальных зачастую весьма сложных по замыслу и исполнению методов. Один из основных — молекулярная гибридизация (образование гибрида) гена или его фрагмента с фиксированными на твердой подложке препаратами хромосом, выделенными из клеток в чистом виде (это называют гибридизацией in situ). Суть метода гибридизации in situзаключается во взаимодействии (гибридизации) между денатурированными (расплетенными) нитями ДНК в хромосомах и комплементарными нуклеотидными последовательностями добавленных к препарату хромосом, индивидуальных однонитевых ДНК или РНК (их называют зондами). При наличии комплементарности между одной из нитей хромосомной ДНК и зондом между ними образуются довольно стабильные молекулярные гибриды. Зонды маркируют предварительно с помощью разных меток (радиоактивных, флуоресцентных или др.). Места образования гибридов на хромосомах выявляют по положению этих меток на препаратах хромосом. Так, еще до появления методов генной инженерии и секвенирования ДНК выяснили, например, расположение в геноме человека генов, кодирующих большие и малые рибосомные РНК (рРНК). Гены первых оказались локализованными в пяти разных хромосомах человека (13, 14, 15, 21 и 22), тогда как основная масса генов малой рРНК (5S РНК) сконцентрирована в одном месте на длинном плече хромосомы 1.
Пример картины, получаемой при гибридизации меченых флюоресцентным красителем генов-зондов, приведен на рис. 10 на цветной вклейке.
Рис. 10. Гибридизация хромосом человека с генами-зондами, мечеными красным и зеленым флюоресцентными красителями. Стрелками указано расположение соответствующих генов на концах двух разных хромосом (справа вверху дано увеличение картины гибридизующихся хромосом).
Гены, расположенные на одной хромосоме, определяют как сцепленные (связанные) гены. Если гены расположены на разных хромосомах, они наследуются независимо (независимая сегрегация). Когда же гены находятся на одной и той же хромосоме (т. е. сцеплены), они неспособны к независимой сегрегации. Изредка в половых клетках могут происходить различные изменения хромосом в результате рекомбинационных процессов между гомологичными хромосомами. Один из таких процессов получил название кроссинговера. Из-за кроссинговера сцепление между генами одной группы никогда не бывает полным. Чем ближе расположены друг к другу сцепленные гены, тем меньше вероятность изменения расположения таких генов у детей по сравнению с родителями. Измерение частоты рекомбинаций (кроссинговера) используется для установления линейного порядка генов на хромосоме внутри группы сцепления. Таким образом, при картировании хромосом первоначально устанавливают, находятся ли данные гены в одной и той же хромосоме, без уточнения, в какой именно. После того, как хотя бы один из генов данной группы сцепления локализуют в определенной хромосоме (например, с помощью гибридизации in situ), становится ясным, что все другие гены этой группы сцепления находятся в той же самой хромосоме.
Первым примером связи генов с определенными хромосомами может служить обнаружение сцепления определенных наследуемых признаков с половыми хромосомами. Чтобы доказать локализацию гена в мужской половой Y-хромосоме, достаточно показать, что данный признак всегда встречается только у мужчин и никогда не обнаруживается у женщин. Группа сцепления женской X-хромосомы однозначно характеризуется отсутствием наследуемых признаков, передающихся от отца к сыну, и наследованием признаков матери.
Особенно важным для изучения генома человека на первых этапах его исследования стал метод, называемыйгибридизацией соматических клеток. При смешивании соматических (неполовых) клеток человека с клетками других видов животных (чаще всего для этой цели использовали клетки мышей или китайских хомячков) в присутствии определенных агентов может происходить слияние их ядер (гибридизация). При размножении таких гибридных клеток происходят потери некоторых хромосом. По счастливой для экспериментаторов случайности в гибридных клетках человек-мышь происходит потеря большей части хромосом человека. Далее отбираются гибриды, в которых остается только какая-нибудь одна человеческая хромосома. Исследования таких гибридов позволили связать некоторые биохимические признаки, свойственные клеткам человека, с определенными хромосомами человека. Постепенно благодаря использованию селективных сред научились добиваться сохранения или потери отдельных хромосом человека, несущих определенные гены. Схема отбора, хотя и не очень проста на первый взгляд, довольно хорошо показала себя в эксперименте. Так, придумали специальную селективную среду, на которой могут выживать только те клетки, в которых синтезируется фермент тимидинкиназа. Если для гибридизации с клетками человека взять в качестве партнера мутантные клетки мыши, не синтезирующие тимидинкиназу, то будут выживать только те гибриды, которые содержат хромосомы человека с геном тимидинкиназы. Таким путем впервые удалось установить локализацию гена тимидинкиназы на хромосоме 17 человека.
Несмотря на то, что изучение генома человека на уровне хромосом дало ряд важных его характеристик, они были самыми общими и дали относительно мало для полного понимания устройства и функционирования генетического аппарата человеческих клеток.
Как двухметровая молекула умещается в микроскопическом ядре?
Как уже говорилось, молекулы ДНК, содержащиеся во всех хромосомах одной клетки человека, имеют общую длину около 2 метров. Это в среднем в миллион раз больше, чем диаметр клеточного ядра, составляющий порядка микрометра. Как же умещаются столь гигантские молекулы в таком маленьком ядре? Изучение структуры хромосом позволило ответить на этот вопрос. Оказывается, в ядре осуществляется «насильственная» упаковка молекул ДНК. Это достигается с помощью специальных механизмов, обеспечивающих изгибание двойной спирали ДНК. Существует несколько уровней «компактизации» ДНК в клетке (рис. 11).
Некоторые из особенностей упаковки ДНК изучены хорошо, а о некоторых существуют пока лишь приблизительные представления. Первый уровень компактизации заключается в накручивании нити ДНК, как нитки на катушку, на специальный комплекс ядерных белков (гистонов).
Рис. 11. Стадии упаковки ДНК в хромосомах (от двойной спирали до целых хромосом)
Нить ДНК делает около двух оборотов вокруг одного комплекса, а затем снова около двух оборотов вокруг второго комплекса и т. д. В результате образуется структура, напоминающая бусы. Отдельные бусинки в этой структуре получили название нуклеосомы. На одной нуклеосоме размещается около 200 пар нуклеотидов ДНК. Между нуклеосомами остается фрагмент ДНК размером до 60 пар оснований, называемый линкером. Этот уровень укладки позволяет уменьшить линейные размеры ДНК в 6–7 раз.
На втором уровне компактизации «бусы» укладываются в спираль, состоящую из шести нуклеосом на виток. При этом линейные размеры ДНК уменьшаются в сумме до 1 мм, т. е. в 25–30 раз.
Третий уровень компактизации молекул ДНК изучен еще плохо. Скорее всего, это петельная укладка фибрилл — образование петельных доменов, которые под углом отходят от основной оси хромосомы (уплотнение в 680 раз). Их можно видеть в обычный световой микроскоп.
На последнем уровне компактизации ДНК происходит ее уплотнение примерно в 10000 раз.
Анализ суммарной ДНК — новые сведения о структуре генома человека
На первом этапе непосредственного исследования структуры генома человека, когда еще не существовала методология генной инженерии, для изучения ДНК применяли традиционные физико-химические методы. В этих опытах использовали суммарные препараты ДНК, целиком выделенные из ядер клеток человека.
Пожалуй, первые сведения о молекулярной структуре генома человека были получены в результате центрифугирования в пробирке растворов ДНК в хлористом цезии при довольно высоких скоростях. В процессе вращения соли цезия создают тонкие слои раствора с различной плотностью (градиент плотности) вдоль пробирки и молекулы ДНК перемещаются в этом градиенте, пока не достигнут такой области, где плотность солевого раствора будет точно такой же, как их собственная. А плотность ДНК сильно зависит от содержания АТ и ГЦ-пар нуклеотидов, т. е., как говорят, от нуклеотидного состава. Оказалось, что основная масса ДНК человека после центрифугирования располагается преимущественно в одной зоне градиента (это соответствует среднему содержанию ГЦ-пар в геноме человека, равному 42%). Однако наряду с этим неожиданно обнаруживались и небольшие (минорные) полосы, в которых также содержались молекулы ДНК, но с иной плотностью и, следовательно, с иным содержанием нуклеотидных пар. Такие минорные, или дополнительные фракции ДНК получили название «сателлитных». Такое имя дали этим фракциям не случайно. В то время как раз был запущен первый советский спутник (лат. satellitis — спутник). Это и натолкнуло исследователей на такое название.
Вскоре после того, как была установлена двухспиральная структура ДНК, обнаружили, что при сильном нагревании ДНК две ее цепи расходятся (расплавляются) и ДНК из двунитевой превращается в однонитевую. Это приводит к нарушению ее естественной структуры, что получило отражение в названии данного процесса — денатурация ДНК. Однако при охлаждении денатурированной ДНК комплементарные цепи находят друг друга и соединяются строго так, как они располагались в исходной неденатурированной молекуле, по типу застежки — «молнии». Этот процесс получил названиеренатурации или реассоциации. Сразу же после обнаружения этого явления оно было использовано экспериментаторами в целях изучения структуры генома.
Немного совсем простой математики для тех самых любопытных, кто недавно закончил ВУЗ, изучал химию и еще не забыл все, чему его учили. Процесс реассоциации ДНК во многом сходен с обычной химической реакцией второго порядка и, по этой причине, может быть описан довольно простой формулой:
Сt /C0 = 1/(1 + k2 (C0 t)),
где C0 и Сt — концентрации однонитевых ДНК соответственно в начальный (нулевой) момент времени и в момент времени t после начала реакции реассоциации, k2 — константа скорости реакции второго порядка.
Для удобства изображения процесса реассоциации строят график, в котором по оси ординат откладывают долю реассоциированных молекул, а по оси абсцисс — величину C0 t. При таком изображении кривые кинетики реассоциации ДНК простейших организмов (вирусов и бактерий) имеют S-образный вид. Это соответствует кинетике химической реакции второго порядка. Если в эксперименте наблюдают отклонения от этой кривой, то это должно указывать на гетерогенность цепей ДНК по скорости взаимодействия друг с другом: одни реагирует быстрее, другие, соответственно, медленнее. Когда ДНК человека порезали на куски небольшого размера и измерили кинетику их реассоциации, то обнаружилось, что кривая, описывающая этот процесс, далека от стандартной (рис. 12).
Это явилось результатом того, что в ДНК человека имеются нуклеотидные последовательности, реассоциирующие с разной скоростью, а суммарная кривая реакции, наблюдаемая в опыте, отражает совокупность множества независимых реакций второго порядка. Когда были проведены эти эксперименты, уже существовал математический аппарат, позволяющий, хотя и очень грубо, вычленять из сложной суммарной кривой отдельные относительно однородные кинетические компоненты. Различия в скоростях реассоциации разных компонентов ДНК человека были связаны с разной представленностью в ДНК отдельных нуклеотидных последовательностей. Участки, которые присутствуют в геноме всего один раз, назвали уникальными. Если в геноме определенная нуклеотидная последовательность не уникальна, а представлена неким числом одинаковых копий (т. е. повторяется, отсюда и название — повторяющаяся), то такая последовательность, естественно, по чисто химическим законам, будет в растворе находить комплементарную цепь и взаимодействовать с ней (реассоциировать) значительно быстрее первой.
В результате такого анализа нашли, что в геноме человека около 75% участков ДНК представлены 1 копией (уникальные) на гаплоидный геном (естественно, в ядре, являющемся диплоидным, имеется 2 копии каждой уникальной нуклеотидной последовательности). Остальную часть генома составляют повторяющиеся последовательности (повторы), среди которых 10% представлены очень быстро реассоциирующими повторами (104 и более копий на геном) и около 15% — умеренными повторами. Заметим сразу, что в дальнейшем эти оценки были существенно пересмотрены. Однако некоторые из этих результатов остались в силе до сих пор.
Рис. 12. Кинетика восстановления двунитевых молекул из искусственно разделенных комплементарных цепей ДНК человека (реассоциация). ДНК разбивают на небольшие фрагменты, денатурируют путем нагревания, а затем при охлаждении разошедшиеся цепи ДНК вновь соединяются. Чем чаще в смеси встречаются те или иные последовательности, тем быстрее они находят друг друга в растворе и реассоциируют. По этой кинетике определяли общее содержание повторяющихся и неповторяющихся (уникальных) нуклеотидных последовательностей в геноме человека
Первоначальные анализы показали, что среди быстро взаимодействующих друг с другом при реассоциации фрагментов ДНК присутствует некоторое количество таких, кинетика реассоциации которых отличается от реакции второго порядка. Причина этому оказалось в том, что эти участки представляют собой так называемые обращенные повторы, илипалиндромы — взаимокомплементарные последовательности, расположенные не на разных, а на одной нити ДНК.
Таким образом, в ДНКовом текте присутствуют «предложения» — палиндромы («перевертыши»), одинаково читаемые слева направо и справа налево. Перевертыши хорошо известны из литературы — это предложения, которые читаются одинаково слева направо и справа налево без учета знаков препинания и интервалов между словами. В качестве примера приведем один из таких перевертышей:
УЖРЕДКОРУКОЮОКУРОКДЕРЖУ.
В ДНК перевертышами называют отрезки двойной антипараллельной спирали, которые имеют одинаковую нуклеотидную последовательность при чтении по обеим цепям в одинаковом направлении. Это выглядит как, например, в ниже приведенном случае:
Здесь стрелками показано направление цепей ДНК, а звездочками — водородные связи, образуемые между парами нуклеотидов. Общее число таких «перевертышей» в геноме человека оценено в интервале от 105 до 106. При этом они относительно равномерно распределены по ДНК.
Имеются в геноме человека и нуклеотидные последовательности, которые на всем своем протяжении построены из одной единственной «буквы». Если в одной цепи ДНК эта буква А, то в другой цепи, соответственно, будет буква Т. Такие участки названы гомополимерными. В случае приведенного выше примера последовательность нуклеотидов записывается, как поли(А) — поли(Т). Таким образом, выяснилось, что в геноме человека (а параллельно это изучали и в геномах других организмов) имеются все варианты нуклеотидных последовательностей, состоящих из 4 «букв», которые только можно себе мысленно представить.
Используя различные модификации метода реассоциации ДНК, установили также, что в большей части генома человека повторяющиеся и уникальные нуклеотидные последовательности перемежаются друг с другом, а средние длины перемежающихся повторяющихся и уникальных фрагментов ДНК составляют соответственно 300 и 2000 п. н.
Приведенные выше данные были, конечно же, усредненными и поверхностно отражали общую картину устройства генома человека. Тем не менее они послужили хорошей основой для дальнейших более углубленных исследований. Важно, что одновременно такие же работы проводились и с использованием других эукариотических организмов. Многие моменты оказались сходными у разных высших организмов и растений. Так постепенно начали вырисовываться в общих чертах основные принципы организации генома человека.
|
